猫头鹰是森林中的捕鼠专家，主要以黑线姬鼠、黑线仓鼠、大仓鼠、棕色田鼠等农田鼠类和小家鼠、褐家鼠等居民区鼠类为主食。除了吃鼠类的动物，也吃一些小型鸟类、哺乳类和昆虫，比如雀类、莺类、蝙蝠、甲虫、金龟子、蝗虫、蝼蛄等。
猫头鹰绝大多数是夜行性动物，昼伏夜出，白天隐匿于树丛岩穴或屋檐中不易见到，但也有部分种类如斑头鸺鹠、纵纹腹小鸮和雕鸮等白天亦不安寂寞，常外出活动；一贯夜行的种类，一旦在白天活动，常飞行颠簸不定犹如醉酒。
猫头鹰一旦判断出猎物的方位，便迅速出击。猫头鹰的羽毛非常柔软，翅膀羽毛上有天鹅绒般密生的羽绒，因而猫头鹰飞行时产生的声波频率小于1千赫，而一般哺乳动物耳朵是感觉不到那么低的频率的。